近期核酸检测的人很多会好奇，已经有了简单方便的免提取核酸试剂，你们还研究核酸提取有什么意义？面对这一问题我想说明的是：核酸免提取试剂面临最大的挑战是：目标基因浓度通常比较少，而不同的样本（如血液、唾液、痰液、尿液、脑脊液、粪便或植物等）又富含抑制物，会影响DNA聚合酶的结构和活性，从而降低PCR检测灵敏度和准确性。理想的免核酸提取直扩反应对核酸扩增体系的要求很高，因为一个试剂中包含了酶、核苷酸、Mg、盐、缓冲液、增强剂和稳定剂等，需要对各组分经过复杂的优化达到平衡的配方，对于直扩型的分子试剂还额外要求具有对抑制物极强的抗干扰能力和特异扩增能力。
二、常见核酸提取方法的背景介绍：
1、酚/氯仿抽提法
根据其不同成分的溶解性能来提取的方法。该方法1956年发明，通过酚/氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后，在水相中主要溶解以DNA为主的核酸成分，在有机相中主要是脂类物质，蛋白质位于两相之间。
2、醇沉淀法
乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来，带正电荷离子能与磷酸基团结合，形成沉淀。
3、层析柱法
通过特殊硅基质吸附材料，能够特定的吸附DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐高PH值洗脱，来分离纯化核酸。
4、热裂解碱法
该方法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离他们，在碱性下，变性蛋白是可溶的。
5、煮沸裂解法
加热处理DNA溶液，利用线性DNA分子的特性，通过离心将DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片形成的沉淀分离。
6、纳米磁珠法
运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在某种盐和外加磁场的作用下，从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
7、其他方法
除了上述常用的方法之外，还有超声法、反复冻融法、固相膜法（滤膜法），酶解法及低渗裂解等方法。快速核酸提取的方法中滤膜法应用不少，接下来我们就结合一篇文章来讲一讲滤膜法的优势与劣势。
三、论文分析：
下面就让我们结合一篇文章来讲讲滤膜法的优势所在。清华大学研究人员在Lab on a chip发表了题为：A filter paper-based microdevice for low-cost, rapid, and automated DNA extraction and amplification from diverse sample typesde的论文，作者提出一种基于滤膜法的快速核酸提取方法，该方法使用基于fusion5滤膜的类三明治多层芯片技术，可以在8分钟内完成核酸的提取工作。全文摘要如下所示：
该设备是基于纸基滤膜的核酸检测装置，其整体结构实物组装图如下图D所示（左侧为高精度的驱动泵，中间为微流控芯片。右侧导管相连的是试剂选择阀），而关键芯片的内部结构示意图如下图A和图B所示（两个滤膜，三层结构），纸基滤膜部位的细节图，如图C所示：
实验试剂的具体用量：
1、DNA extractions from 2 μL of human whole blood and blood stains on 903® paper.
2、A 25 μL PCR mixture, consisting of 0.425 μL of each amelogenin primer,
3、12.5 μL of MasterMix,
4、 10.525 μL of DI water,
5、 0.625 μL of PEG (160 μg μL−1 , poly(ethylene glycol), MW 10 000),
6、0.5 μL of BSA (50 μg μL−1 ), was loaded into the permanently bonded microchip using the
syringe pump.
实验注意事项：
1、 Inlets and outlets were sealed completely with ARseal™ tape.
2、 The entire chip was placed upside down in a thermal cycler with a flat heating block (Mastercycler
Nexus Flat, Eppendorf, Hamburg, Germany).
3、To compensate for the temperature difference between the heating surface and the chip, a calibrated thermal cycling protocol was used,
4、PCR反应时间：including an initial activation at 96 °C for 5 min, followed by 35 cycles of 97 °C for 45 s, 51 °C for 35 s and 72 °C for 30 s, and a final extension step for 10 min at 72 °C. After PCR, the tape was carefully removed and the products were taken out with a pipette for gel electrophoresis.
芯片所谓的三明治结构也就是PMMA+PDMS+PMMA的多层结构，这样能够保证芯片流道的密闭性。至于原因吗？大家可以看看下图的原理解释：
原来，由于PDMS和PMMA的分子结构比较特殊，形成了很好的热互补效应。当70摄氏度的时候，将两种样本挤压在一起，两者的表面会发生化学反应，导致两者的表面结合的非常紧实。
不同纸基的滤膜提取效果如下图所示：
总结：作者创新性的提出一种基于滤膜的核酸提取芯片，该芯片在辅助装置的驱动下，可以完成DNA的捕获。由于该芯片集成了两种滤膜的缘故，该方法能够在8分钟之内捕获全血的DNA和血渍上的DNA。
该论文的优势总结如下：1、快速的核酸提取效率。2、便宜的设备和低廉的化学耗材成本。3、自动化的核酸提取流程。4、通用的人类基因样本核酸提取适用性。5、非常容易的核酸提取和扩增集成方法。6、三明治结构的芯片合成技术非常容易实现，仅仅需要70多摄氏度的温度和一定的应力就可以方便的完成芯片的结合，给批量化生产带来很好的条件。
那么最重要的核酸提取的效果如何呢？作者使用本次芯片对比商业化的QI Aamp DNA Micro kit发现，即使是对比商业化的专业核酸提取装置，该方法的有效性也是更胜一筹。具体效果如下图所示：
文章还可以提高的地方：
1、采用的微流控芯片需要将每个出入口用胶带密封后采用专业的扩增设备进行扩增，操作比较复杂，对设备要求较高。论文提到需要：a flat heating block (Mastercycler Nexus Flat, Eppendorf, Hamburg, Germany)
2、扩增完成后小心的去掉胶带，使用凝胶电泳等终点测试法读取最终的结果。无法达到实时荧光定量的目的。论文指出After PCR, the tape was carefully removed and the products were taken out with a pipette for gel electrophoresis.
参考文献：
1、A filter paper-based microdevice for low-cost,rapid, and automated DNA extraction and amplification from diverse sample typesde.2、百度百科及其相关发布
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